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Q-琼脂糖凝胶FF是一种强阴离子交换填料，将三甲胺基烷基季铵基团键合在高流速琼脂糖微球上而形成。广泛用于生物制药和生物工程下游蛋白质、核酸及多肽的离子交换制备。

本制品具有高化学稳定性、高流速、高载量、好的机械性能、可在位清洗、多次重复使用等特点，非特异性吸附低，回收率高，适用于工业规模生产，适用于在pH工作范围内可形成负离子的生物大分子的分离纯化，广泛用于生物制药和生物工程下游蛋白质、核酸及多肽的离子交换制备。

离子交换填料广泛用于生物制药和生物工程下游蛋白质、核酸及多肽的分离纯化。主要包括强酸性阳离子交换填料、弱酸性阳离子交换填料、强碱性阴离子交换填料和弱碱性阴离子交换填料四种。本制品四种离子交换填料均以高交联的6%琼脂糖为介质，可耐受较高的流速及更高的化学稳定性，适合实验室及工业大规模纯化，压力/流速曲线见图1。

产品应密封贮存在4℃～25℃（保存溶液为20%乙醇），通风、干燥、清洁的地方。不能冷冻。用过的柱子贮存在4℃（20%乙醇）。避免与氧化剂接触；避免在pH<4的环境中长时间暴露(一周，20℃)。

• 缓冲液的准备：
  所用水和缓冲液在使用之前建议用0.22μm或0.45μm滤膜过滤。
  所使用的平衡液和洗脱液，根据不同离子交换填料自行选择。基本原则是低盐上样，高盐洗脱。
  
• 样品准备：
  样品在上样前建议离心或用0.22μm或0.45μm滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。
  
• 介质装填：
  
  • 重力柱的装填：
    下面以CM-琼脂糖凝胶FF为例介绍填装重力柱的方法。
    
    • 取合适规格的重力层析柱，装入下垫片，加入适量纯水润洗柱管和垫片，关闭下出口。
      
    • 将CM-琼脂糖凝胶FF混合均匀，用枪头吸取适量浆液加入至重力柱中（介质实际体积占悬液的一半），打开下出口流干保护液。
      
    • 加入适量纯水冲洗介质，待柱管中液体重力流干后，关闭下出口。
      
    • 装入润洗后的上垫片，确保垫片与填料之前没有空隙，且保持水平。
      
    • 装填好的重力柱可以直接加入平衡液进行平衡，暂不使用时则加入保护液，4～30℃保存。
  • 中压层析柱的装填：
    CM-琼脂糖凝胶FF、DEAE-琼脂糖凝胶FF、Q-琼脂糖凝胶FF被广泛应用于工业纯化，因此，涉及到各种中低压色谱层析柱的填装，下面以CM-琼脂糖凝胶FF为例介绍填装层析柱的方法。
    装柱前根据层析柱直径计算柱子底面积，根据所需装柱高度计算所需介质体积，公式如下：
    V=1.15πr²h
    V：所需介质体积ml；1.15：压缩系数；r：柱管半径cm；h：装填高度c。
    
    • 所取悬液体积应为介质体积的两倍，因为介质体积只占悬液总体积的一半，另一半为保护液。
    • 用去离子水冲洗层析柱底筛板与接头，确保柱底筛板上无气泡，关闭柱底出口，并在柱底部留出1-2cm的去离子水。
      
    • 将介质悬浮起来，小心的将浆液连续地倒入层析柱中。用玻璃棒沿着柱壁倒入浆液可减少气泡的产生。
      
    • 如果使用储液器，应立即在层析柱和储液器中加满水，将进样分配器放置于浆液表面，连接至泵上，避免在分配器或进样管中产生气泡。
      
    • 打开层析柱底部出口，开启泵，使其在设定的流速下进行。最初应让缓冲液缓慢流过层析柱，然后缓慢增加至最终流速，这样可避免液压对所形成柱床的冲击，也可以避免柱床形成的不均匀。
      如果达不到推荐的压力或流速，可以用你所使用泵的最大流速，这样也可以得到一个很好的装填效果。（注意在随后的色谱程序中，不要超过最大装柱流速的75%）当柱床高度稳定后，在最后的装柱流速下至少再上3倍柱床体积的去离子水。标上柱床高度。
      
    • 关闭泵，关闭层析柱出口。
      
    • 如果使用储液器，去除储液器，将分配器置于层析柱中。
      
    • 将分配器推向柱子至标记的柱床高度处。允许装柱液进入分配器，锁紧分配器接头。
      
    • 将装填好的层析柱连接至泵或色谱系统中，开始平衡。如果需要可以重新调整分配器。
• 样品纯化流程：
  
  • 孵育法纯化：
    
    • 根据纯化的样品量，取适量CM-琼脂糖凝胶FF加入离心管中，1000rpm离心1min，吸弃上清；也可加入重力柱中，流干保护液。
      
    • 向离心管中加入5倍介质体积的平衡液清洗介质，1000rpm离心1min，吸弃上清；如使用重力柱，则直接在重力柱中清洗，直接重力流干平衡液；重复两次以上。
      
    • 加入样品，封闭离心管或重力柱管，4℃振荡孵育2～4h或者37℃孵育30min～2h。
      
    • 孵育结束后，1000rpm离心1min，吸弃上清，或过滤收集介质，上清保留作为流穿，用于电泳鉴定。
      
    • 用5倍介质体积的洗杂液清洗介质，1000rpm离心1min或重力柱管过滤，去除上清（注意不要吸到介质），重复3～5次，中间建议更换新离心管。
      
    • 加入3～5倍柱体积的洗脱液进行洗脱，室温孵育10～15min，1000rpm离心1min或重力柱管收集洗脱液，可重复2～3次。
  • 重力柱法纯化：
    
    • 将装填好的CM-琼脂糖凝胶FF重力柱用5倍柱体积平衡液进行平衡，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲液体系下，重复2～3次。
      
    • 将样品加到平衡好的重力柱中，样品保留时间至少2min，保证样品和介质充分接触，收集流出液，可以反复上样增加结合效率。
      
    • 用10～15倍柱体积的洗杂液进行洗杂，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。
      
    • 使用5～10倍柱体积的洗脱液洗脱，分段收集，每一个柱体积收集一管，分别检测，既可以保证所有结合的目的蛋白被洗脱，又可以得到高纯度和高浓度的蛋白。
  • 中压层析柱法纯化：
    CM-琼脂糖凝胶FF装填好后，可以用各种常规的中低压色谱系统。
    
    • 将泵管道中注满去离子水。去掉上塞子，将层析柱连接至色谱系统中，打开下出口，将预装柱接到色谱系统中，并旋紧。
      
    • 用3～5倍柱体积的去离子水冲洗出储存缓冲液。
      
    • 使用至少5倍柱床体积的平衡液平衡色谱柱。
      
    • 利用泵或样品环上样。
      
      • 样品的粘度增加使得即使上样体积很少，也会导致层析柱很大的反压。
        
      • 上样量不要超过柱子的结合能力。
        
      • 大量的样品体积也可能造成很大的反压，使得进样器更难使用。
    • 用洗杂液冲洗柱子，直到紫外吸收达到一个稳定的基线（一般至少10～15个柱体积）。
      
    • 用洗脱液采用一步法或线性梯度洗脱。一步洗脱中，通常5倍柱体积洗脱液就足够了。梯度洗脱可以用一个小的梯度，例如20倍柱体积或更多，来分离不同结合强度的蛋白质。
• SDS-PAGE检测：
  将使用纯化产品得到的样品（包括流出组分、洗杂组分和洗脱组分）以及原始样品使用SDS-PAGE检测纯化效果。

• 常规清洗：
  离子交换填料每次使用后可以用1M NaCl甚至更高离子强度溶液或高pH溶液清洗，然后用至少5倍柱体积的平衡液进行平衡，至离子强度或pH值稳定。
  
• 在位清洗(CIP)
  离子交换填料可以重复使用而无需再生，但随着非特异性结合的蛋白的增多和蛋白的聚集，往往造成流速和结合载量都下降，这时可按照下面方法对填料进行清洗。
  去除一些沉淀或变性物质，建议使用下面的方法：
  用2倍柱体积的1M NaOH溶液进行清洗，然后立即用5倍柱体积的PBS(pH7.4)清洗。
  去除一些疏水性吸附造成的非特异性吸附物质：
  用3～4倍柱体积的70%乙醇或3～4倍柱体积的1% Triton X-100清洗，然后立即用5倍柱体积的PBS(pH7.4)清洗。
  去除一些离子键结合物质：
  用3～4倍柱体积的2M NaCl清洗，然后立即用5倍柱体积的PBS，pH7.4清洗。
  
• 填料保存：
  
  • 未使用的填料储存在带盖容器中，将盖子拧紧置于4～30℃保存。
    
  • 使用过的填料，先用纯水冲洗5倍柱体积，再用20%乙醇冲洗2倍柱体积以上，然后将填料置于4～30℃保存，建议每间隔1～2个月用20%乙醇冲洗2倍柱体积以上置换旧保护液。

• 柱子反压过高
  原因：填料被堵塞，按照以上说明进行填料清洗。裂解液中含有微小的固体颗粒，建议上柱前使用滤膜(0.22或0.45μm)过滤，或者离心去除。
  
• 洗脱样品较杂
  
  • 填料重复多次使用：按照以上说明进行填料清洗或更换新填料。
    
  • 洗杂不充分：增加洗杂液体积，确保填料充分平衡/洗杂。
    
  • 样品带电性能相似：优化洗脱条件。

• 装柱：
  
  • 让所有的材料和试剂达到室温。配制初始缓冲液（平衡液）和洗脱缓冲液。
    
  • 根据柱子大小取所需量的凝胶，清洗掉20%乙醇，抽干，用初始缓冲液（按凝胶∶缓冲液=3∶1的比例）配成匀浆。
    
  • 将柱内及柱子底端用水或缓冲液润湿并保持一小段液位（液面略高于滤膜），务必使底端无气泡。
    
  • 用玻璃棒引导匀浆沿着柱内壁一次性倒入柱内，注意勿使产生气泡。打开柱子出液口，使凝胶在柱内自由沉降，连结好柱子顶端柱头。
    
  • 打开蠕动泵，让缓冲液用使用时流速的1.33倍的流速流过，使柱床稳定。用2～3倍柱体积的缓冲液平衡柱子。
• 平衡：
  让平衡缓冲液以一定流速流过柱子，到流出液电导和pH不变。平衡液是低浓度的缓冲溶液，如Tris、PBS等。
  
• 上样：
  
  • 样品用平衡液配制，浑浊的样品要离心和过滤后上样。盐浓度太大的样品处理后再配。
    
  • 一般情况是让目标产品结合在柱子上，用平衡液洗去杂质，再选择一种洗脱液洗下目标产品。
    
  • 介质对样品组分吸附的程度取决于样品的带电性质、流动相的离子强度和pH值。盐浓度小，介质对样品组分吸附较牢。用DEAE介质时，推荐的pH值是小于目标产品等电点1个单位。
• 洗脱：
  Q-琼脂糖凝胶FF介质可用增大盐浓度或减小pH值进行洗脱，常用增大盐浓度的办法洗脱。
  
• 再生：
  
  • 一般用高盐浓度的缓冲液（含1~2mol/L NaCl）洗或减小pH洗10倍以上柱体积，接着用结合蛋白的平衡液洗到平衡，可再次使用。
    
  • 若有失活蛋白质或脂类物质在再生时洗不掉，可用在位清洗(CIP)除去。
• 在位清洗CIP：
  
  • 对于以离子键结合上去的蛋白，可以用2M NaCl去除。
    
  • 对沉淀蛋白、对以疏水性结合的蛋白或脂类，可用1M NaOH去除。
    
  • 对强疏水性结合的蛋白、脂类等，用4～10倍柱体积的70%乙醇或30%异丙醇清洗，但要注意有机溶剂的浓度以梯度的方式逐渐增加，否则容易产生气泡。
    
  • 清洗完毕后，用至少3倍缓冲液平衡柱子。
• 注意事项：
  
  • 在装柱、使用和保存柱子的时候，要避免柱子流干，气泡进入。
    
  • 在使用过程中，不能使用强酸，如使用酸洗，应使用浓度低于0.1M的冰醋酸。
• 去热源：
  用0.5M的氢氧化钠清洗柱子5～6小时或用0.1M的氢氧化钠24小时。或用以下方法步骤去除：
  
  • 2倍柱体积的70%乙醇。
    
  • 2倍柱体积50mM Tris-HCl(pH7.5)。
    
  • 1倍柱体积4M尿素。
    
  • 3倍柱体积的Tris缓冲液+0.1M NaCl。
  • 以上缓冲液都在无热源的双蒸水中配制。
• 消毒：
  用0.5~1M NaOH室温下洗8～10倍柱体积，初始缓冲液平衡柱子。
  
• 灭菌：
  置介质于高压灭菌锅中120℃下30分钟。